hibridizacija in situ yra metodas chromosomų aberacijoms nustatyti. Tam tikros chromosomos pažymėtos fluorescenciniais dažais ir surištos su DNR zondu. Ši technika naudojama prenatalinei genų mutacijų diagnostikai.
Kas yra in situ hibridizacija?
Hibridizacijos in situ arba Hibridizacija in situ nukleorūgštys iš RNR ar DNR aptinkamos tam tikruose audiniuose ar ląstelėje naudojant molekulinius genetinius metodus. Paprastai tokio tipo diagnozė naudojama norint nustatyti struktūrinį ar skaitinį chromosomų anomaliją nėštumo metu.
Šiuo tikslu naudojamas dirbtinai pagamintas zondas, kuris pats susideda iš nukleorūgšties. Tada jungiasi su nukleorūgštimis organizme per bazių poras. Ši jungtis reiškia hibridizacijos terminą. Įrodymai grindžiami gyvąja paciento struktūra, todėl atitinka in situ įrodymus. Tai reikia atskirti nuo in vitro metodų, kai aptikimas atliekamas mėgintuvėlyje. Metodą sukūrė XX amžiuje mokslininkai Joe Gall ir Mary Lou Pardue.
Nuo to laiko technologijos vystėsi. Nors tuo metu buvo naudojami radioaktyvieji zondai, pavyzdžiui, šiandien naudojami fluorescenciniu būdu žymimi zondai, turintys kovalentinį ryšį su žymeklio molekulėmis.
Funkcija, poveikis ir tikslai
In situ hibridizacija dažniausiai naudojama aptikti chromosomų aberacijas, t. Y. Chromosomų anomalijas, kurių neįmanoma nustatyti kariogramoje. Todėl metodas visada naudojamas nustatant paveldimas ligas nėštumo metu.
Kadangi chromosomų aberacijos yra problema, kurios šiandien nereikėtų nuvertinti, metodo naudojimas laikui bėgant išaugo. Hibridizacija vyksta naudojant motinos amniono natūralias ląsteles. Technologijos pagrindas yra spalvomis pažymėto zondo surišimas su DNR dalimis. Įrišimo dėka kopijų skaičių vėliau galima įvertinti mikroskopu, nes atskiros kopijos skleidžia šviesos signalą ir gali būti matomos po mikroskopu. Yra skirtingos procedūros. Bet kuri analizė atliekama iškart po surišimo.
Tokiu atveju naudojamas fluorescencinis dažiklis, toks kaip biotinas, kuris yra tiesiogiai surišamas su DNR zondu. Taikant netiesioginį hibridizacijos in situ metodą, įvertinti negalima iškart po hibridizacijos, nes fluorescencinės medžiagos gali prisijungti prie zondo tik po hibridizacijos. Šis netiesioginis metodas naudojamas dažniau nei tiesioginis, nes manoma, kad jis yra jautresnis. Be chromosomoms būdingų centrometrinių DNR zondų, taip pat yra lokuso specifiniai DNR zondai, chromosomoms būdingi DNR bibliotekos zondai ir lyginamosios genomo hibridizacijos.
Chromosomos specifiniai centrometro DNR zondai gali būti naudojami aptikti chromosomų skaitines anomalijas. Tai reiškia, kad jie daugiausia naudojami, kai yra įtarimas dėl dubliuotų ar ištrintų chromosomų. Vietos specifiniai DNR zondai yra ypač tinkami aptikti minimalias mutacijas, kurių neįmanoma aptikti kariogramoje. Įterpimams ir translokacijoms nustatyti ypač naudojamas chromosomoms būdingas DNR bibliotekos zondas.
Kita vertus, lyginamoji genomo hibridizacija yra išsami chromosomų medžiagos nuostolių ir padidėjimo analizė. Šiandien in situ hibridizacija yra labai svarbi diagnozuojant įvairias chromosomų mutacijas.Diagnozuojant Dauno sindromą, zondai jungiasi, pavyzdžiui, su 21 chromosoma. Tam tikslui dažniausiai naudojami chromosomoms būdingi zondai, kurie gali būti naudojami įtarus šią ligą.
Įtarimas gali kilti, pavyzdžiui, jei tėvai anksčiau pagimdė sergantį vaiku ir ultragarsinis vaizdas yra nenormalus. Jei vietoj dvigubos jungties yra trigubas ir tokiu būdu išvedamas trigubos spalvos signalas, diagnozė laikoma patvirtinta.
Rizika, šalutinis poveikis ir pavojai
Skirtingai nei, pavyzdžiui, PGR, hibridizacija in situ yra žymiai mažiau jautri užteršimui. Be to, procesui reikalingas laikas yra žymiai mažesnis. Kadangi embrionai visų pirma sudaro chromosomų struktūrą, modelio negalima naudoti siekiant tiksliai nustatyti likusį chromosomų pasiskirstymą ir tokiu būdu kitų ląstelių genetinę būklę.
Spalvoti signalai taip pat gali persidengti arba likti nematomi dėl kitų priežasčių. Dėl to hibridizacija in situ, kaip diagnostikos priemonė, yra gana linkusi į klaidas nėštumo metu. Gali kilti klaidingų diagnozių, ir tėvai gali nuspręsti nenaudoti sveiko embriono. Norint sumažinti hibridizacijos in situ jautrumą klaidoms, reikėtų ištirti bent dvi embriono ląsteles vienu metu. Ištyrus dvi ląsteles lygiagrečiai, dabar yra tik nereikšminga klaidingos diagnozės rizika.
Tokiu atveju tėvai gali visiškai pasikliauti diagnoze. Hibridizacija in situ nėra siūloma kiekvienai nėščiai moteriai, bet tik rizikos grupės moterims. Nepaisant to, nėščiosioms nepaneigiama tokio tipo diagnozė jų pačių prašymu. Nenormalūs ultragarso radiniai ar nenormalus serumas gali paskatinti gydytoją pasiūlyti diagnostinę procedūrą. Nors didelę, bet jokiu būdu ne visus, chromosomų aberacijas galima diagnozuoti naudojant in situ hibridizaciją.
Todėl hibridizacijos in situ niekada negalima atlikti atskirai, ji visada turi būti naudojama kartu su įprastu chromosomos tyrimu. Šioje procedūroje svarbų vaidmenį vaidina nėščios moters priežiūra. Prieš analizę yra išsamiai aptariama su būsima mama apie diagnostikos metodą, kuriame paaiškinama rizika, technologijos galimybės ir galimybės.
